MeiraGTx Holdings plc kondigt aan dat het bedrijf acht posters zal tentoonstellen en één mondelinge presentatie zal geven op het European Society of Gene and Cell Therapy (ESGCT) 2023 Annual Congress, dat wordt gehouden van 24-27 oktober 2023 in Brussel, België. Poster #122: Ontwikkeling van alternatieven voor Triton X-100 cellyse voor AAV2, AAV5 en AAV8 primair herstel; Categorie: AAV & niet-integratieve vectoren; Triton X-100 is een effectief reinigingsmiddel voor het terugwinnen van biologische producten uit intracellulaire compartimenten, maar het gebruik ervan is nu verboden door de REACH-regelgeving (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) omdat de afbraak ervan een verbinding genereert die een negatieve invloed heeft op het waterleven. Het doel van dit werk was om alternatieve methoden voor Triton X-100 te ontwikkelen voor het terugwinnen van Adeno-Associated Virus (AAV) uit menselijke embryonale niercellen 293, die in overeenstemming zijn met REACH, compatibel zijn met Good Manufacturing Practice (goede productiepraktijken), de productkwaliteit niet aantasten en een vergelijkbare productterugwinning vertonen in vergelijking met lysis met Triton X-100.

Twee alternatieve AAV-vrijgavemethoden werden geëvalueerd voor AAV2-, AAV5- en AAV8-serotypes: 1) Een hyperosmotische vrijgavemethode zonder detergent werd aanvankelijk getest op microtiterplaatschaal met behulp van een Central Composite Design of Experiment-aanpak, alvorens op te schalen naar 250 ml geroerde tankreactor (STR)-schaal. 2) Indien niet geschikt, werd een lysemethode met Deviron C16 detergens getest op 250 mL STR-schaal met concentraties variërend van 0,1 tot 0,5%. Ten slotte werden succesvolle omstandigheden voor beide methoden opgeschaald naar een STR-schaal van 10 L.

Voor het AAV8-serotype werd een hyperosmotische AAV-vrijgavemethode gebruikt door toevoeging van 400 mM NaCl en incubatie gedurende 2 uur, wat leidde tot een VG-herstel van ~70% ten opzichte van de oude Triton X-100-methode. Voor AAV2- en AAV5-serotypen bleek een 0,5% Deviron C16-lysemethode het meest geschikt, wat resulteerde in VG-terugvindingen van respectievelijk 87% en 97% ten opzichte van AAV-vrijgave met Triton X-100. Er waren geen veranderingen in het downstreamproces nodig om deze alternatieve methoden toe te passen.

Bovendien waren beide methoden schaalbaar tot 10 L STR-schaal en werden procesgerelateerde onzuiverheden, waaronder residueel DNA en gastheercelproteïnen, en de productpotentie niet beïnvloed door deze methoden. Concluderend kunnen we stellen dat dit onderzoek twee geoptimaliseerde alternatieve AAV-vrijgavemethoden heeft laten zien ter vervanging van het gebruik van Triton X-100, die vergelijkbare productherstel- en productkwaliteitsprofielen lieten zien. Poster #167: Potentiebepaling cellijnontwikkeling voor oculaire gentherapievectoren; Categorie: AAV & niet-integratieve vectoren; Bij de productie van GMP AAV-geneesmiddelen is de mogelijkheid om de potentie te beoordelen een essentieel onderdeel van de vrijgave en stabiliteit.

Op cellen gebaseerde potency assays zijn een wettelijke vereiste voor de commercialisering van AAV gentherapieën, maar de slechte in-vitro transduceerbaarheid van AAV en het onvermogen om de expressie te testen door het gebruik van weefselspecifieke promotors belemmeren de ontwikkeling van efficiënte en robuuste assays. Ook fundamenteel preklinisch onderzoek, waar eenvoudig te implementeren testen voor snellere experimenten en iteraties wenselijk zijn, lijdt aan dezelfde beperkingen. Het bedrijf ging daarom op zoek naar manieren om de transduceerbaarheid van de vector te verhogen en de trans-activatie van de oculaire promotor in de meest gebruikte cellijnen (HEK293 en HeLa) vast te stellen.

Het bedrijf beoordeelde verschillende methoden om de transceerbaarheid van AAV5- en AAV8-vectoren te verhogen en om fotoreceptorspecifieke (Rhodopsine kinase) en RPE-specifieke (RPE65) promotors te transactiveren. In experimenten met verschillende doseringen werden krachtige dCas9-gemedieerde transactivatoren voor beide promotors geïdentificeerd en werd een exogene factor toegevoegd die de transduceerbaarheid van beide capsids meerdere malen verhoogde ten opzichte van de uitgangswaarde. Verdere studies zullen het mogelijk maken om deze te combineren in een in vitro celgebaseerd potency assay platform voor GMP batchvrijgave en stabiliteitstesten.

Poster #324: Gebruik van mechanistische modellering om een platformproces te ontwerpen voor de scheiding van volle en lege AAV-capsids; Categorie: Productie Adeno-geassocieerde virussen zijn een relatieve nieuwkomer op het gebied van biofarmaceutische modaliteiten en worden gebruikt om een therapeutisch gen aan een patiënt toe te dienen. Tijdens de productie worden afzonderlijke cellulaire processen gebruikt om het virale kapsel en het therapeutische transgen te produceren en het transgen in het kapsel te verpakken. Dit leidt tot de expressie van lege capsiden, die tijdens het downstreamproces verwijderd moeten worden omdat ze een immuunrespons in de patiënt kunnen stimuleren.

De scheiding van lege capsids vormt een uitdaging vanwege de overeenkomst in eigenschappen tussen de lege en de volledige capsids. Het aandeel lege capsïden kan sterk variëren en oplopen tot 90%, afhankelijk van de rijpheid van het upstreamproces, wat de uitdaging om deze scheiding tot stand te brengen nog groter kan maken. De meeste pogingen zijn gericht op het gebruik van anionuitwisselingschromatografie om het verschil in lading te benutten om deze scheiding te bereiken.

Er is echter veel diversiteit in de gepubliceerde benaderingen, waarbij sommige groepen verschillende matrixtypes (harsen, membranen en monolieten), procesomstandigheden en additieven gebruiken. Company heeft eerder aangetoond dat zwakke partitionering kan worden gebruikt om de aanrijking van volledige capsiden te maximaliseren, waardoor de beschikbare opties voor deze scheiding nog verder toenemen. Het vaststellen van een platformproces omvat meestal het screenen van een aantal opties, waarbij heuristieken worden gebruikt om de ontwerpruimte te verkleinen en de experimentele belasting te verminderen.

Dit leidt er meestal toe dat procesopties vergeleken worden onder suboptimale omstandigheden en het risico bestaat dat het optimale platform niet geïdentificeerd wordt. Deze presentatie zal zich richten op werk dat gedaan is om aan te tonen dat mechanistische modellen gebruikt kunnen worden om een optimaal platformproces te identificeren voor de aanrijking van AAV2 volledige capsiden. In dit onderzoek werden mechanistische modellen ontwikkeld voor de scheiding van volle en lege AAV2-capsids voor drie AEX-matrices die eerder veelbelovend waren gebleken tijdens experimentele evaluaties.

Deze modellen werden vervolgens gebruikt om een reeks procescondities (zoutconcentraties, belastingsverhoudingen) en de werkingsmodi (binden en elueren, doorstromen, zwakke partitionering) te onderzoeken en de optimale condities voor elke matrix te identificeren. Tot slot werden de geïdentificeerde optimale condities experimenteel geverifieerd.